凝胶搬动实验有称凝胶隔绝实验或电泳搬动率实验(EMSA,electrophoretic mobility shift assay),是一种用于卵白与核算相互作用的工夫。起先是用于转录因子与运转子相互作用的考据性实验调教,也可运用与卵白-DNA、卵白-RNA互作有计划。 一、实验旨趣
EMSA主要基于卵白-探针复合物在在凝胶电泳经由中搬动较慢的旨趣。确认实验缱绻特异性和非特异性探针,当核酸探针与样本卵白羼杂孵育时,样本中不错与核酸探针联结的卵白质与探针酿成卵白-探针复合物;这种复合物由于分子量大,在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳时搬动较慢,而莫得联结卵白的探针则较快;孵育的样本在进行聚丙烯酰胺凝胶电泳并转膜后,卵白-探针复合物会在膜靠前的位置酿成一条带,证明有卵白与方针探针发送互作。 二、实验操作门径
1、实验前准备
(1)合理的实验决议
确认有计划方针合理缱绻特异性探针实验组以及非特异性探针对照组,如有必要还不错添加特异性抗体组、特异性核酸竞争组等
(2)样本制备
不错聘任索求样本的总卵白、核卵白或者使用纯化好的方针卵白。对样本卵白进行定量,实验中等量加入卵白。
(3)探针制备
确认实验要求缱绻不同的探针并添加符号,不错合成核酸后自行添加,部分已知卵白有买卖化的抗体也不错平直购买。当今大多半实验室仍是不再使用辐射性符号,生物素使用相对较多。 2、酿成卵白-探针复合物
(1)在0.5ml离心管中按规章将下列组份混匀:
卵白样本(2-5μg) Xμl poly d(I-C) 1μl Binding Buffer 2μl Nuclease-Free ddH2O Xμl 总体积 9μl(2)冰浴5min后,加入1μ探针。(对照组加1ul对照探针)
(3)PCR仪中室温(20-23℃)温育30min。 3、制备凝胶,电泳
(1)制备6.5%非变性聚丙烯酰胺凝胶:(详实确认试剂情况按比例调停总体积)
5XTBE 1ml 30